生物工程下游技术第十章_有机高分子基质的HPLC填料.ppt

a.多孔树脂的IEC填料: 柱效、穿透性、分离度、负载量、回收率的性能优异 Mono Beads 系列：包括Mono Q, Mono S, Mono P SOURCE系列:15Q,15S,30Q,30S 贯流色谱填料POROS系列 羟基化聚醚凝胶：如TSK gel DEAE-5PW,SP-5PW,CM-5PW等 交联聚甲基丙烯酸羟基乙酯:亲水,大孔 b.非多孔树脂的IEC填料: 羟基化聚醚,交联聚苯乙烯,交联聚甲基丙烯酸酯,交联琼脂糖等。 优点:颗粒小,均匀,刚性好,色谱穿透性强,流速适应范围宽。避免了固相内的吸附与扩散，因此具有高柱效,高分离度和高样品回收率的特点。 c.薄壳型树脂的IEC填料: 优点:柱效高,选择性好,分离度高,穿透性好,回收高,流速快等 有机高分子类型的疏水HPLC填料Hydrophobic interaction chromatography,HIC HIC:填料表面具有弱疏水性,蛋白质的疏水基团与填料表面之间产生弱的疏水性相互作用。高浓度盐条件下,蛋白质与疏水固定相的吸附能力高,随着盐浓度的下降,吸附能力下降。当淋洗液离子强度逐渐降低时,蛋白质样品按其疏水性的不同依次被洗脱。 常见淋洗液有(NH4)2SO4, NH4Ac, NaCl,磷酸盐等,其中(NH4)2SO4是最广泛应用的。 与RPC比较在原理上的区别及其优缺点? 六、疏水色谱HPLC填料 一般是亲水性基质,或在合成的非亲水性基质上连接一定的亲水基团，然后引入疏水性基团,主要有丁基、辛基、苯基等以及聚乙二醇。 其基质可以是多糖类,也可以是各类高分子多聚物,包括交联聚苯乙烯树脂、硅胶、羟基化聚醚树脂、交联甲基丙烯酸酯类。 HIC填料绝大多数是多孔结构,主要是超大孔结构，也可以是非多孔结构的。 P206表10-4 七、有机高分子类型的空间排阻HPLC填料Size exclusion chromatography, SEC SEC填料特征： 填料的性质必须与溶质和淋洗体系相匹配,可以被淋洗剂所浸润； 填料和试样尽可能不发生任何基团之间的相互作用,即尽可能避免非空间排阻效应； 填料的多孔结构是SEC建立的基础； SEC填料的色谱特征： 除了柱效,选择性,分离度,穿透性等一般色谱表征外,尚需要满足以下指标： 排阻极限; 分离范围; 固流相比 凝胶填料主要类型 多糖类 传统的软质凝胶:葡聚糖,琼脂糖,聚丙烯酰胺型凝胶 高交联的多糖类凝胶:Superdex,Superose, Sephacryl, Sepharose CL 高聚物型 多孔交联聚甲基丙烯酸酯类树脂,交联聚乙烯醇树脂,亲水化处理的交联聚苯乙烯树脂,羟基化聚醚类.(表10-7 P213) 凝胶渗透色谱Gel permeation chromatography, GPC 有机溶济为流动相 THF四氢呋喃 有机高分子类型生物亲和HPLC填料Affinity chromatography, AFC 优点:高选择性,能有效保持生物分子的高级结构稳定性,活性样品的回收率。 按其基质不同分:多糖型和高聚物型。 按其所带配体对被分离物质的选择性特征可分为通用型和专用型。 DEAE——二乙氨乙基，十八烷基：C18、辛烷基：C8 * * 第十章 有机高分子基质的高效液相色谱分离柱填料 首先回顾几个问题 HPLC方法的主要特点有那些？ HPLC的主要设备分哪几部分？ HPLC方法的主要特点 分离效率高，选择性好，适于各种多元组分复杂化合物的分离 应用范围广：无机物—有机物，天然物质—合成产物，小分子---大分子，一般化合物到生物活性物质 分离机理各异，色谱柱、淋洗体系和操作参数选择广泛 分离纯化+分析检测 样品量从痕量到大规模制备，实现在线监测和自动化操作。 HPLC的关键设备 专用的高压输液系统; 高灵敏检测系统; 高效分离柱 其中分离柱是色谱的中心,是最为关键的部分 与经典色谱的比较 HPLC分离填料： 有机基质 多糖型凝胶 高聚物树脂 无机基质 硅胶 氧化锆 氧化铝 多孔玻璃 羟基磷灰石 石墨化碳黑 基质微球——天然多糖或合成单体或交联剂 负载样品的能力强，色谱容量高 耐酸碱、具化学稳定性，柱寿命长，易再生 不易产生非特异性吸附作用 一、HPLC色谱柱的关键在于填料 物理结构→色谱动力学 （粒度与粒度分布、孔径与孔径分布、颗粒强度和表观形态→柱效率、穿透性） 化学结构→色谱热力学 （连接在基质上的官能团或链段→样品保留值、选择性） 1、HPLC色谱柱填料在物理结构上的要求: 颗粒大小合适，粒度分布较窄; 颗粒强度适应高速高压操作; 多孔型的孔径大小和孔径分布适宜,避免复杂的微孔结构; 一定的溶胀及收缩水平。 常见的液相色谱填料类型 多孔型 非多孔型 薄壳型 分：小孔（10nm）、中