山羊PrRP基因CDS区克隆及序列分析.pdfVIP

2010，VOLUME12，NO．1ANIMALBIOTECHNOLOGYBULLETIN151 山羊P艘P基因CDS区的克隆及序列分析 李转见1，张瀚元1，蓝贤勇1，王璩1，王爱兰1，雷初朝1，房兴堂2，陈宏1’ (1西北农林科技大学动物科技学院陕西省农业分子生物学重点实验室，陕西杨凌， 712100；2徐少HI)O范大学细胞与分子生物学研究所，徐州221116) 引言 催乳素释放肽(prolactinreleasing 脑提取物中分离出来。催乳素释放肽是一种神经肽，在延髓、下丘脑等多种组织中分布，对 催乳素的分泌具有促进作用，同时影响摄食、能量平衡、应激、睡眠等生理活动。因此，催 乳素释放肽基I矧是一个非常重要的与家畜经济性状密切相关的候选基因。目前，国内外对人、 牛和大鼠该基|大l进行了大量研究。然而至今，PrRP基因的分子遗传机制在山羊中的研究尚 未见报道。因此，我们对山羊的脚基因进行了克隆和生物信息学分析等初步研究。 材料与方法 (1)供体羊为四周岁，第三胎泌乳后期的西农萨能奶山羊。剪取1g左右山羊乳腺组织， 迅速投入液氮保存备用。利用Trizol一步法提取总RNA。(2)根据GenBank牛(NC007301) ． 序列如下：PrRPF：5’ 一TCATGTGCGCTCACCl]rrG3’，PrRPR：5- _CACGCAGACACGTATG．3’。 cDNA第一链合成按照TaKaRa公司试剂盒说明操作。利用 RT—PCR方法扩增PrRP基因CDS区。用小量DNA片段快速胶回收试剂盒回收目的条带，与 pGM．T载体连接，转化感受态TOPl0，提取质粒经酶切鉴定正确后测序。(3)分别利用 CLUSTAL ProtParam对P俄P基因进行核营酸以及编码氨基酸的同源性分 W2(1．83)、ExPaSy 析及催乳素释放肽的组成预测。 结果 盒操作说明合成第一链cDNA，然后用引物P脚F和脚R进行PCR扩增，得到目的条 带。PCR产物纯化后，进行TA克隆，测序后得到山羊一RP基冈CDS区序列。(2)序列 的生物信息学分析：利用软件CLUSTAL W2(1．83)进行多序列比对，结果表明奶山羊PRLH 基因与绵羊(AF450453)、牛∞C007301)、人附C900002)、小鼠NC900067)和鸡 (NM 酸的同源性分别为94％，94％，74％，67％和49％。利用ExPaSyProtParam对催乳素释放肽的 组成进行预测，发现该段序列共编码98个氨基酸，相对分子量为10．60KDa；理论等电点为 cm一1 11．01，分子式C467H757N1490126S4，消光系数(M—lX=280nm)为12615，N端为甲硫氨 酸，半衰期约为30d时。此蛋白的不稳定系数为59．73，属于不稳定的蛋白质。 讨论 催乳素释放肽对催乳素和体内的其他激素的释放和分泌都有调节作用，因此成为国内外 信号肽研究的热点之一。人、小鼠、大鼠、牛、绵羊、山羊脚cDNA编码区分别有264， 261，252，297，297，297个碱基，编码不同长度的氨基酸残基，但都有共同的 为RF肽。其中，牛、绵羊、山羊尸缏P基凶CDS的长度相同，同源性也非常高，与他们有着 相似起源，且都是高度同源的反刍动物一致。 陕西省“131 15”科技创新工程项目(No．2008ZDKG一11)和江苏省自然科学基金(BK2008120) ’通讯作者。