以HAP为填料高效清相色谱纯化rIL-2方法的研究.pdfVIP

以HAP为填料高效液相色谱纯化rlL．2方法研究 郝 茜 闫 颖 范国梁赵秋雯 支j迎五 王建林万冬林 (天津大学分析中心天津300072)(中国医学基金会医学生物技术研究所300191) 1前言 但在早期研究中，IL．2的制备提纯方法既复杂又昂贵。由于几一2在治疗肿瘤、增强免疫 力等方面具有广泛的应用前景，为此国内外对此进行了大量的研究工作。国内外分离提纯 大多采用反相高效液相色谱法(RP．}Ⅱ，Lc)梯度洗脱来提纯儿一2。本研究尝试在一种新的 填料HAP上用梯度洗脱的方法分离纯化rII。一2。研究结果表明，用本实验方法，大量上样 提纯后的r儿一2在纯度、含量、活性等方面均满足要求，效果良好。 2实验部分 2．1试剂及仪器 蒸馏水：去离子水再通过石英自动双重水蒸馏器蒸馏；羟基磷灰石填料，中科院化工 6．8的磷酸盐缓冲液20， 冶金研究所#等摩尔数的磷酸二氢钠与磷酸氢二钠混合液配成pH 物制品公司 (使用之前需处理…)；聚乙二醇，分子质量l000睢llooO，日本进口分装； i．d．；紫外检测器8823B型，北京新技术应用研究所；zsB．Ⅲ型输液泵与m．Ⅲ型流量调 节仪，天津市科器高新技术公司；A4500型数据处理机，北京未来科学技术研究所。 2．2实验方法 (1)样品 将含有重组人IL2基因的E．coli经过细胞增殖培养后收集菌体，菌体经超声破碎， 离心收集后得到包含体。将包含体溶于 A45∞ 7m01，L的盐酸胍．EDTA删s中，rII。-2 处于还原状态． (2)样品前处理 将样品液稀释10倍，并加入适量 固体盐酸胍使其浓度为1．5mol，L，再加 入cu”浓度为50umol，L，氧化复性后 通过se口hadex G-25柱以蒸馏水为流动 相脱盐酸胍。图1．2分别为标准IL-2 与盐酸胍流经sephedex G-25凝胶柱的 圈1 (上)标准rIL-2通过s．ph|d·。G-25的谱图 色谱图。接收18min~25min的吸收峰， 田2(下)盐酸厦通过seohadesQ_衢的港田 合并，用透析袋浓缩即为以HAP为填 ．317． 料的HPLc的上样液。 2．3 HPLC的分离制备 以HAP为填料，用匀浆式填充法填装制备柱，lOcm×2．2cmi．d．，HAP柱在使用之 前用300mmol，L的磷酸盐缓冲液清洗，然后用20mmol／L的磷酸盐缓冲液平衡待用。 分离提纯条件：以pH6．8的磷酸盐缓冲液为流动相。流速为9．5mL／min。 梯度洗脱条件见下表。每次样品分离后用300mmoI，L的磷酸盐缓冲液冲洗柱子 3结果与讨论 时间(min)流动相浓度mmol，L O～5 20 图3为以HAP为填料的高效液相制备色谱分离提 5～10 50 l¨15 100 纯rIL．2的谱图。进样后，收集19miII以2min的峰，即 15—J25 200 图中第4个峰，台并冻干后即为纯品rIL．2。 A4500 - 一 a b c d 圈3 MP分离样品色谱围 圈4 rIL-2的电泳圉 G．25凝胶柱脱盐时”1