水牛Fat1基因打靶的初步的研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第卜六届学术研i,-t会论文集 水牛Fatl基因打靶的初步研究 庞春英1，邓廷贤1，梁贤威1，杨春艳1，王建1，郑海英1，黄芬香1，覃广胜1，唐冬生2， 杨炳壮 (1．中国农业科学院广西水牛研究所，农业部(广西)水牛遗传繁育重点实验室，广西南宁 530001；2．佛山科学技术学院医学院，广东佛山528000) 引言 Omega-3多不饱和脂肪酸对人体健康尤其在预防和治疗心脑血管疾病、癌症等多种疾病 方面有着重要作用。因此，构建水牛乳腺生物反应器，提高水牛奶中多不饱和脂肪酸的含量， 对人体健康具有重要意义。本研究拟以水牛rRNA基因的间隔序列为靶位点，构建含外源基 因Fatl和标记基囚EGFP的水牛多位点基因打靶载体，为建立适用于动物体内基因定点敲入 和转Fatl基因水牛打靶技术奠定基础。 材料与方法 儿肾脏成纤维细胞为广西水牛研究所细胞工程实验室保存。以水牛rRNA基因家族的间隔序 为模板，采用LA．PCR技术扩增标记基因EGFP和外源基因Fatl，随后采用基因工程操作技 术克隆上诉四个片段至pBCl，构建水牛基因打靶载体。采用脂质体法将基因打靶载体转染 至水牛胎儿肾脏成纤维细胞，在荧光显微镜下观察载体的表达情况。 结果 经PCR鉴定和DNA测序验证表明：已成功构建了水牛乳腺特异性真核表达载体 lbp、EGFP 长为l，951bp和Fatl长为l，227bp。经脂质体法转染基因打靶载体至水牛胎儿肾脏成纤维细 胞，目前研究表明转染效率较低，为20％。 讨论 对于转基因研究而言，选择合适的载体高效的表达外源基因以及将外源基因有效的整合 到受体基因组是至关重要的。选择组织特异性表达的调解元件，使外源基因在乳腺组织中特 异性表达是转基因水牛乳腺生物反应器成功的关键问题之一。本研究选择的pBCl载体是一 种乳腺特异性真核表达载体。该载体包含真核表达功能元件山羊13-casein启动子，可利用山 羊13-casein启动子来指导重组蛋白在乳腺组织高效特异性表达。此外，初步探究了脂质体法 对水牛胎儿肾脏成纤维细胞转染的影响。较低的转染效率会阻碍外源基因有效的整合至受体 基因组。因此，本研究下一步计划将是进一步提高外源基因的转染效率，并进行基因表达分 析验证定点整合效率和Fatl基因在细胞的表达和功能情况。另外，获取含Fatl基因的水牛 成纤维细胞单克隆，为进一步进行核移植得到转基因水牛提供关键材料。