产胞外耐高温纤维素酶细菌的获得和酶的纯化及性质研究.pdfVIP

维普资讯 第 l9卷第 1期 常 州 工 学 院 学报 Vo1．19 No．1 2006年2月 JournalofChangzhouInstituteofTechnology R ．2oo6 产胞外耐高温纤维素酶细菌的获得和 酶的纯化及性质研究 贺 芸 (常州工学院．江苏 常州213002) 摘要：对从高温堆肥中分离得到的一株产胞外耐高温纤维素酶的细茵进行了生理生化鉴定，结 果显示其属于嗜热脂肪芽孢杆茵。对其所产纤雏素酶进行 了分离纯化，该酶反应的最适温度约为 66℃。最适pH值为7．0，至少有8个亚基。 关键词：耐高温纤维素酶；嗜热脂肪芽孢杆茵；提纯 中图分类号：Q2—33 文献标识码：A 文章m~：1671—0436(2006}O1-0013—05 纤维索是地球上最丰富的可再生生物聚合物。它作为一种具有巨大潜力的可再生资源，依赖于人 们对纤维素酶的发现和认识。耐高温纤维素酶因其耐热性在生产中具有实用意义 ，而成为一研究热 点…。本实验从高温堆肥中筛得一株产胞外耐高温纤维素酶的芽孢杆菌，经鉴定该菌属嗜热脂肪芽孢 杆菌(Bacillusstearothermophilus)。熊世勤等_2】1998年筛选得到过能产耐高温纤维素酶的类似嗜热脂 肪芽孢杆菌的菌种，但未见其就所产酶的酶学特性进行研究的报道。因此，本实验对该菌所产纤维素酶 进行了分离纯化和酶学特性的研究。通过对酶反应产物的鉴定，判断所产纤维素酶主要有类似外切B 一 1，4一葡聚糖酶(eXO—B一1，4一glucanase，EC3．2．1．74)的活性，属于Reese等(1950年)提出的不同 酶协同作用分解天然纤维索的C1一Cx假说中的Cx酶的一种。另外，在以凝胶电泳对酶进行纯化鉴定 的过程中发现该纤维素酶具有多亚基结构。多亚基纤维素酶最初是由Lamed等人在厌氧嗜热的分解 纤维素菌Clostridiumthermoeellum中发现的 J，其后在其他的一些厌氧的细菌和真菌中发现类似结构， 最近在好氧细菌中也有发现 ¨】。酶的各亚基在酶与底物反应的过程中起吸附、连接、催化等多种作 用 J，本实验获得的纤维素酶中各亚基功能还需进一步深入研究。 1 材料及方法 1．1 培养基 筛选培养基：KH2P040．05％，MgSO40．03％，FeSO40．01％，MnSO40．01％，CaC120．02％，羧甲基 纤维素钠(CMC—Na)0．05％，蛋白胨0．2％，琼脂1．5％，1moVLNaOH调 pH为7．0。种子培养基不加 琼脂，其他成分与筛选培养基相同。发酵培养基成分与种子培养基相同。 1．2 采样及筛选方法 夏季用柴草高温堆肥，在其高温区随机取样。 筛选方法见参考文献[5]。筛选条件为好氧66．5℃。在复筛过程中分别测其发酵液、10000r／min 离心20min后上清液、无菌滤膜过滤所得无菌滤液的酶活，以说明其产胞外酶。 收稿 日期：2005-11-11 维普资讯 14 常州工学院学报 2006年 1．3 酶活测定方法 纤维素酶活(CMC酶活和滤纸酶活)测定方法均见参考文献 [6]。其中还原糖的测定方法为3，5 一 二硝基水杨酸DNS比色法 。酶反应条件为 pH7．0，温度 66℃。两种酶活力单位均定义为在 pH7．0，温度66℃，每分钟产生相当于1txmol葡萄糖的还原糖所需的酶量为1个酶活力单位(U)。 1．4 纤维素酶的纯化方法 操作在4℃下完成。66．5℃培养48h后的发酵液 10000r／min离心20min，取上清，加硫酸铵至 饱和度20％，再取上清，加硫酸铵至饱和度60％，取沉淀溶于pH7．0的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液中， 获得粗酶液，透析脱盐并浓缩。脱盐粗酶液经 SephadexG一100柱 (1．0cmX20cm)层析，用磷酸