PCR问题与提高特异性方法总结.pdfVIP

活性蛋白整体方案 PCR 问题与提高特异性方法总结 摘要：本文根据自身实验经验总结，针对PCR实验过程出现的问题举例，提供可实施的解决方法。并根据经验列举 了提高PCR反应特异性的方法。 关键词：PCR常见问题 PCR特异性 PCR常见问题分析 问题1：假阴性（无扩增产物） 现象：正对照有条带，样品无条带 可能原因： a）模板：含有Taq酶抑制剂、杂蛋白，模板上样量低或模板降解 b）引物：引物降解，引物设计不合理 c）试剂：酶失活，buffer不合适 d）反应条件：退火温度高，延伸时间短 解决方法： a）纯化模板并重新提取，并检测模板是否含有抑制剂 b）重新设计引物并低温保存 c）优化buffer，摸索镁离子浓度或适当加入DMSO （小于0.3%） d）提高退火温度，增加延伸时间（反应条件参照试剂盒说明书） 问题2：假阳性 现象：空白对照出现条带 可能原因： a）引物设计不适，与目的序列具有同源性 b）试剂污染：水、移液枪等被核酸污染 c）样品间出现交叉污染 解决方法： a）实验仪器高压灭菌 b）实验试剂（酶除外）高压灭菌，离心管枪头一次性使用 c）规范实验操作 d）假阳性可通过巢式PCR解决，或者使用特异性较高的试剂盒扩增 问题3：拖尾、弥散 现象：电泳出现拖尾、涂抹带 可能原因： a）酶用量过多 b）模板纯度较低 c）dNTP、镁离子浓度过高 d）循环次数过多 解决方法： a）减少用酶量或使用特异性高的热启动酶扩增 b）纯化模板 c）减少dNTP用量，摸索镁离子浓度 网址： 活性蛋白整体方案 d）减少循环次数 问题4：二聚体及非特异性产物 一般小于100bp的条带可基本判断为引物二聚体 主要原因： a）引物设计不合理，引物自身具有互补性 b）引物浓度不适 c）镁离子浓度过高，退火温度过低 解决方法： a）重新设计引物并进行BLAST检测 b）降低镁离子浓度，提高退火温度 c）增加模板用量 提高PCR反应特异性的方法 a）引物的设计 引物最好在模板cDNA的保守区设计，长度15-30bp，GC含量小于60%，3’端不超过连续三个G或C，碱基分布错 落有致，避免引物自身形成二聚体，设计完成之后，需进行BLAST检测，如果与其他基因不具有互补性，则可以进 行下一步实验。 b）降落PCR 降落PCR是一种简单的降低非特异性产物的PCR，最大的优点就是可以降低实验耗时，同时又可以优化实验的步骤。 引物的设计决定退火温度，退火温度过高会使PCR效率过低，过低则会使非特异扩增过多。这虽然可以通过反复尝 试来优化，但费时费力。降落PCR提供了一个较为简易的优化方法。首先在较高的温度下扩增，此时虽然扩增效率 低，但非特异扩增基本没有。随着退火温度的降低，非特异扩增会逐步增多。但由于此时特异的扩增产物已经达到 一定的数量优势，因此会对非特异扩增产生强烈的竞争抑制，从而大幅提高PCR的特异性和效率。 c）热启动扩增 采用热启动方法进行扩增，是除了设计最佳引物之外，提高PCR反应特异性最好的方式。在一般的PCR反应中，试 剂的配置需在冰上进行，且要将PCR仪预热，这种方法就类似于热启动，能够一定程度的抑制错配。但是酶在低温 下也存在活性，只要体系中有DNA链存在，就会扩增产生非特异性条带。采用热启动的方法就是在达到变性温度之 前完全抑制酶的活性，而最有效的方法就是使用热启动Taq酶 （或热启动高保真聚合酶）去扩增，它的原理就是采 用化学修饰的方法封闭酶的活性中心，当温度上升到95℃时恢复活性，指导扩增。 d）巢式PCR 采用巢式PCR进行扩增，在多轮扩增结果中提高扩增特异性和灵敏度。与普通PCR不同的是，它采用两对引物进行 扩增，首先用第一对引物普通PCR，然后将第一轮扩增的产物稀释100倍后用第二对引物（巢式引物）二次扩增。 因此采用巢式PCR可以大大增加困难模板扩增的特异性和有限靶序列的灵敏度。 e）合适的琼脂糖凝胶的浓度 琼脂糖凝胶浓度与DNA分离范围 琼脂糖凝胶浓度 DNA分离范围 0.3% 5000-60000 0.5% 1000-30000 0.7% 800-12000 1.0%