山姜属传统中药DNA分子鉴定的研究.pdfVIP

医药学与生物学分册 山姜属传统中药DNA分子鉴定研究’ 赵志礼① 钟国跃① 王峥涛② 董 辉② 徐珞珊② (①太撮集团博士后流动站，重庆413啪10；⑦中国药科大学．南京216038) 摘要 传统中药红豆蔻、草豆蔻、益智的原植物分别来自于山姜属的红豆蔻 Alp／n／a K．Schum与益智A galanga(L．)Sw，草豆蔻A．hainanensis oE姊)，妇M曝采用PcR直接测序法，首次测定了它们以及同属16种 1+ITS 近缘植物的核糖体DNArlxs区序列，三者序列长度(ITS2)分 别为412bp，403bp，404bp，序列间具有67个变异位点(包括5．8s编码 区)：进一步的分析表明该片段在山姜属植物种同有很好的分辨率，本 工作为山姜属中药材的DNA分子鉴定提供了必要的序列资料。、 关键词 山姜属红豆蔻草豆蔻益智核碧体DNAITS区序列 Roxb．)植物国产近50种“1，它们具有很高的药用价值，不少传统中药 山姜属(A／／,／n／a 如红豆蔻、草豆蔻、益智等，其原植物均来自山姜属，另据文献报道以及我们的实地调查”’， 山姜属大部分种群在不同地区作药用。但由于该属植物共性明显，种内个体变异幅度较 大。以及一些原始文献描述过于简单等原因，长期以来，属下等级的划分不尽一致，一些种群 的界限不甚清晰，给该属药用植物的基源鉴定带来很多困难，加之长期以来山姜属中药材 品种混乱现象严重，这些问题经典方法已难以有所突破。 近年来。分子生物学的飞速发展给解决植物系统学中的许多疑难问题以及确定一些分 类群的系统位置提供了有力证据，并开始应用于对中药材的鉴定，取得了令人瞻目的结 果【3一】。核糖体DNA中的内转录间隔区(n弓)序列是核基因组中常见的一个DNA片断，国 内外学者的研究表明，其在被子植物系统学研究中，尤其在属级种间甚至居群间具有较高 的价值”一)。为此首次测定了山姜属传统中药红豆蔻、草豆蔻、益智以及其它16种近缘植 ITS区序列。以期为该属中药材分子标记物的确定以及进一步的鉴定打 物的核糖体DNA 下坚实的基础。 1实验 1．1材料 用于提取DNA的材料为新鲜叶片，原植物经作者鉴定其学名，赁证标本藏于中国药科 -国家自然科学基金资助项目。 590 2000年中国博士后学术大会论文集 大学药用植物标本馆(GPU)，详纽晴况见表l。 表1实验材料来源及赁证标本 1．2总DNA提取 参考Doyle＆Doyle的总DNA提取方法o“，并加以改动，具体步骤如下：取适量新鲜叶 0)， 0．02M 积的饱和酚，3／5体积的氯仿一异戊酵(24：1)混合液，轻轻摇匀后，6013水浴保温15rain，离 心；取上清液，加入等体积的氯仿一异戊醇(24：1)混合液，混匀．离心；取上清液，用2倍体积 的无水乙醇沉淀bNA，离心之后，倾出液体，将沉淀物用70％乙醇洗涤3-5次，风干加入 dmO重悬DNA；于412静置12小时以上，再次离心；最后，弃去沉淀物，上清液 80--160tJ 一20℃保存备用。 1．3 ITS区片段的PCR扩增与产物纯化 PCR扩增的引物为Pl(5’一CGT，AAC，AAG，GTr，TCC，GTA，G∞，GAA，C3’)、P2 26S(包括5．8S编码区)片段。反应体积为30m，其中含10×tCRbuffer3,t，Mga：(25mM01) DNA 2}d，dNIP poly— memse(5U／”I)0．2～0．25