人工伴侣辅助溶菌酶复性地研究.pdfVIP

人工伴侣辅助溶菌酶复性的研究 史晋辉董晓燕孙彦 (天津大学化工学院生物化工系，天津，300072) 摘-Jt-本文研究了去污荆十六烷基三甲基溴化铵(CTAB】和O．环糊精(B-CD)联夸作用(人工 伴侣系统)，时变性-ft．原溶菌酶的复性作用．考察了操作条件对溶茵酶夏性收率的影响．结果表明， 在^工伴侣系统辅助下，60rain可使变性溶菌酶的复性收率速89％，自发复性仅为27％；并且其最 佳复性温度为370c，最佳pH值为7．9：同时发现．单独使用环糊精也可在一定程度上辅助溶茴酶 复性，复性收率为46％． 关键词人工伴侣，复性，去污荆．环糊精．溶茴酶 引言 变性蛋白的肽链伸展，疏水基外露，在变性剂浓度降低的复性条件下，伸展肽链间由于疏水 相互作用而聚集沉淀。因此．在复性过程中抑制肽链间的疏水相互作用是提高复性收率的关键。 近年来人们对此进行了诸多研究，如向变性蛋白溶液中加入适当浓度的聚乙二醇f11；调节复性液 中盐酸胍浓度l’】；利用凝胶过滤色谱介质的分子筛作用13I等．均可防止肽链聚集，提高蛋白质的 复性收率。其中，最引人注目的是以GroEL为代表的分子伴侣系统，其辅助复性机理已得到证 放多肽链，从而辅助蛋白质复性pI。 最近，Rozema和Gellman的研究发现，环糊精和去污剂联合作用也可辅助蛋白质复性盱”。 其复性过程分两步进行：第一步在变性蛋白质溶液中加入去污剂，去污剂分子与蛋白质疏水位点 结合形成复合体，抑制肽链间的相互聚集：第二步加入环糊精，由于环期精分子对去污剂分子有 竞争性吸附作用，去污剂分子被剥离，启动多肽链开始正确折叠成为活性蛋白。受GroEL辅助 蛋白质复性机理的启发，由于其作用机理类似于分子伴侣GroEL，因此称其为人工伴侣系统口～I。 达85％t：I。为了探讨短时间高效辅助变性溶菌酶复性的可能性，本文利用阳离子表面活性剂十六 烷基三甲基溴化铵(CTAB)和B．环糊精(13一CD)联合作用，对变性．还原溶茵酶进行了复性， 并优化了复性条件。 1材料和方法 1．I试剂 购于日本和光纯工业公司，B．环糊精(分析纯)购于华北特种试剂中心(天津)．其它试剂均为 分析纯。 I．2溶菌酶的变性 DTT和6mol，L 将tSg／L溶菌酶溶液(含有30mmoI／L 置于370C、120r／min的摇床水浴中反应lh，使溶菌酶彻底变性和还原口1。 1．3溶菌酶的复性 0．1moLL、 434 0．57mmoI，I。、CTAB1．7mmoVL、 GdmCl91．4retool，L、DTT0．17mmoI／L、GSH5．7mmoI／L、GSSG u 溶菌酶S5．7g／mL)混合．室温静置10分钟后，再加入环糊精溶液，最终复性波中含0，lmol／L D，rr、4．0mmoI／L 1．1 GSH、 g／mL溶菌酶、64mm01／L盐酸胍、0．12mm01／L Tris．Sulfate(pH8．5)、60 0．4mmoI，LGSSG、1．2mmoVL 水浴中复性Ih。 1．4溶菌酶活性的测定 u 溶菌酶活性。向1．5mL底物溶液中加入100L溶菌酶，测定反应液在450hm下的吸光值，以两 分钟内吸光值的降低速率，求出变化斜率，与100％酶活相比即得相对酶活性m。 2结果与讨论 2．1人工伴侣对变性溶菌酶的复性作用 变性溶菌酶的自发复性及人工伴侣(CTAB+CD)促进复性结果示于图1。由图可见，在人 工伴侣的作用下，复性60rain即可使溶菌酶的复性收率由初始活性的0升高到89％，而自发复 性收率仅为27％。如仅加入CTAB而不加B—CD，不仅不能辅助蛋白质复性．反而抑制其自发复 性．使复性率几乎为零。说