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第34卷 分析化学(FENxIHuAxuE)研究报告 第2期 Chinese of 187～190 2006年2月 Joumal Chemistry Analytical 一种基于肽质量指纹谱技术鉴定蓖麻毒素的新方法 闫 妍 张淑珍 唐吉军 顾明松 冯建林 谢剑炜4 (军事医学科学院毒物药物研究所，北京l00850) 测定蓖麻毒素的分子量为62925Da，实现了蓖麻粗毒的凝胶电泳分离，并通过胶内酶切获得了蓖麻毒素的肽 质量指纹谱(PMF)；经过数据库检索，在输入检索的22条肽段中有17条获得了匹配。检索结果显示，利用生 物质谱技术是鉴定蓖麻毒素的最有效的新方法之一。 关键词蓖麻毒素，肽质量指纹谱，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，生物质谱 1 引 言 自蓖麻毒素(ricin)惊现英国首都伦敦以后，各国已经开始高度关注生物恐怖袭击；而在全世界广泛 种植的蓖麻由于其廉价高毒且无有效的解毒药更是成为了关注的焦点。Ricin是从大戟科植物蓖麻 键组成异二聚体。其中，A链为效应链，具有糖苷酶活性，有使核糖体失活的能力；B链为结合链，含有 糖体失活而被广泛用于抗癌免疫毒素的研究∞’4J。目前，国内外还没有对人适用的有效解毒药或疫苗， 临床上主要根据不同的症状采取对症治疗。因此，建立对Ricin快速有效的检测鉴定方法，对于中毒的 提早防治具有重要的现实意义，引起了各国军事医学家及分析化学家极大的研究兴趣。 对于Ricin的检测，使用较多的是免疫技术¨一¨，优点是灵敏度高、便于i受4定生物样本(如血样、尿 样)。但由于抗体制备困难，有交叉反应，操作复杂，耗时冗长等缺点，不能满足当前快速检测的需要。 近年来新兴起的生物质谱(biomass (EsI)等质谱软电离技术的发展恰恰弥补了这一空白，为分析强极性、热不稳定性和难挥发性的生物样 品提供了优越的技术手段隅]。其中肽质量指纹谱(PMF)结合数据库检索的方法鉴定蛋白质，是目前较 为常用的鉴定方法[9。2l。由于蛋白质的氨基酸序列各不相同，被酶切位点专一的蛋白酶水解后所得的 肽混合物具有特征性，称为指纹谱，可用于蛋白质的鉴定。应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 析速度快、灵敏度高。本研究利用MALDI—TOF生物质谱技术结合肽质量指纹谱方法，经过数据库检索， 建立了鉴定检测Ricin的新方法。 2 实验部分 2．1仪器与试剂 MiniPROTEAN 蛋白酶(ModmedSequencing Biosci— ences公司)；实验用水均为亚沸水。 2005旬3．19收稿；2005_08—15接受 本文系国家自然科学基金资助(No 万方数据万方数据 分析化学 第34卷 2．2实验方法 2．2．1硒ciIl的制备【1副蓖麻子去壳碾碎后匀浆，磷酸盐缓冲液(PBS)浸提离心去沉淀可得到蓖麻粗 毒，再经过亲和层析和凝胶过滤进行分离纯化。 2．2．2质谱测定条件N：激光源，波长337nm，正离子线性方式检测(飞行管长1．6m，加速电压 20 以1：1的比例混合。分子量测定：纯化后的Ricin对双蒸水透析24 0．5％TFA溶 h，冻干后用5—10¨L 解混匀，离心后取上清液与等体积的基质混合点靶，MALDI—TOF／MS测定。 2．2．3SDS—PAGE电泳条件5％浓缩胶，12％分离胶，10mA恒流运行20min，再恒流20mA运行至 溴酚蓝前沿到达分离胶底部。考马斯亮蓝R-250染色1—2h，脱色至蛋 白条带清晰可见(图1)。 2．2．4瑚dn的胶内酶切及肽质量指纹谱的制备胶内酶切将SDS— PAGE中的分子量大约为63．OkDa的斑点(如图1所示)切下并切成约 1 mm