微生物方法学(模板).docVIP

5.5微生物限度 依据《中国药典》2000年版一部附录XIII C微生物限度检查法，依法对三批中试产品进行检查，结果见表15-6。 表15-6 金刚藤分散片微生物限度检查结果 批号 031219 031221 031223 细菌总数 霉菌总数 大肠杆菌 活 螨 80 10 未检出 未检出 60 10 未检出 未检出 100 10 未检出 未检出 结论：本品三批中试产品微生物限度检查均符合规定。 2005年版药典对微生物限度检查提出了新的要求，因此，在对准备送检的三批样品检验时，参照《中国药典》2005年版一部附录XIII C进行，试验如下： 5.1.1细菌、霉菌及酵母菌的检查 菌种 金黄色葡萄球菌（Staphlococcus aureus）[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98 001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98 003]、大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（F）44 102] 菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中，35℃培养24小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，25℃培养48小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，28℃培养7天，加入5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，用管口带有薄的无菌纱布的无菌毛细吸管吸出孢子悬液至无菌试管中，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。 计数方法验证 供试液的制备：取050815批样品10g，加pH7.0的无菌氯化钠-蛋白栋缓冲液至100ml，振摇，使溶解，作为1：10的供试液。 回收率试验 （1）试验组：取1：10供试液1ml和上述50cfu/ml的三种试验菌1ml，分别注入直径90mm的无菌平皿中，立即倾注20ml温度不超过45℃的营养琼脂培养基（细菌计数）或玫瑰红钠琼脂培养基（霉菌、酵母菌计数），混匀，凝固，倒置培养，每株试验菌平行两份。 （2）菌液组：取上述50～100cfu/ml的三种试验菌1ml，分别注入直径90mm的无菌平皿中，同上述方法进行试验。 （3）供试品对照组：取1：10供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，同法进行试验。 取上述各组样品，分别进行培养，计数，计算试验组各试验菌的回收率，试验结果见表15-7。 （试验组各试验菌平均菌落数—供试品组平均菌落数）×100% 回收率（%）= 菌液组平均菌落数 表15-7 各试验菌回收率试验结果 菌种 试验组 平均菌落数 供试液对照组 平均菌落数 菌液组 平均菌落数 回收率 （%） 金黄色葡萄球菌 130 60 80 87.5 125 60 80 81.3 145 60 80 106.3 枯草芽孢杆菌 120 60 70 85.7 125 60 70 92.9 115 60 70 78.6 白色念珠菌 120 60 65 92.3 110 60 65 76.9 120 60 65 92.3 黑曲霉 118 60 55 105.5 105 60 55 81.8 116 60 55 101.8 大肠埃希菌 118 60 60 96.7 110 60 60 83.3 122 60 60 103.3 结果表明：各试验菌的回收率大于70%，本品无抑菌作用，对检查无干扰，可以用该方法检查本品的微生物限度。 三批样品的微生物限度检查 （1）供试液：取050815、050817、050819批样品各10g，分别加pH7.0无菌氯化钠-蛋白栋缓冲液至100ml，置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1：10的供试液。取1：10供试液10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白栋缓冲液至100ml，作为1：100的供试液。 取三批样品的1：10供试液和1：100的供试液各1ml分别置直径90mm的无菌平皿中，注入20ml温度不超过45℃的营养琼脂培养基（细菌计数）和玫瑰红钠琼脂培养基（霉菌、酵母菌计数），混匀，凝固，倒置培养，每个供试液平行两份。 （2）阴性对照：取上述稀释液各1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。三批样品的检查结果见表15-8。 表15-8 三批样品微生物限度检查结果 批号 稀释 级别 培养基 培养温度（℃） 培养时间（h） 细菌数 霉