RACE原理及其应用.docVIP

RACE 的简介 目前，全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。尽管已经 有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的 基因丰度较低，从而使得由低丰度 mRNA 通过转录获得全长 cDNA 很困难。近年来 发展成熟的 cDNA 末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长 cDNA 提供了一个便捷的途径。 cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术是一 种基于 mRNA 反转录和 PCR 技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点，扩 增基因转录本的未知区域，从而获得 mRNA(cDNA)完整序列的方法。简单的说就是 一种从低丰度转录本中快速增长 cDNA5’和 cDNA3’末端，进而获得获得全长 cDNA 简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点，可同时获得多个 转录本。因此近年来 RACE 技术已逐渐取代了经典的 cDNA 文库筛选技术，成为克 隆全长 cDNA 序列的常用手段。 第二 RACE 的原理 RACE 是采用 PCR 技术由已知的部分 cDNA 顺序来扩增出完整 cDNA5’和 3’ 末端，是一种简便而有效的方法， 又被称为锚定 PCR (anchoredPCR)和单边 PCR(one2side PCR)。 3’RACE 的原理 一)加入 oligo(dT)17 和反转录酶对 mRNA 进行反转录得到(-)cDNA； 二)以 oligo(dT)l7 和一个 35bp 的接头(dT17-adaptor)为引物， 其中在引物 的接头中有一在基因组 DNA 中罕见的限制酶的酶切位点。这样就在未知 cDNA 末 端接上了一段特殊的接头序列。再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链 (-)cDNA 退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。 三)利用 3amp 和接头引物进行 PCR 循环即可扩增得到 cDNA 双链。扩增的特 异性取决于 3amp 的碱基只与目的 cDNA 分子互补．而用接头引物来取代 dT17 一 adaptor 则可阻止长(dT)碱基引起的错配。 5’RACE 的原理 5’RACE 与 3’ RACE 略有不同。首先，引物多设计了一个用于逆转录的基 因特异引物 GSP-RT；其次，在酶促反应中增加了逆转录和加尾步骤，即先用 GSP-RT 逆转录 mRNA 获得第一链(-)cDNA 后，用脱氧核糖核酸末端转移酶和 dATP 在 cDNA5’ 端加 poly(A)尾，再用锚定引物合成第二链(+)cDNA，接下来与 3’ RACE 过程相同。用接头引物和位于延伸引物上游的基因特异性引物(5amp)进行 PCR 扩增。 全长 cDNA 的获得 通过 RACE 方法获得的双链 cDNA 可用限制性内切酶酶切和 southem 印迹分 析并克隆。 通常的克隆方法是同时使用一个切点位于接头序列上的限制性内切酶 和一个切点位于扩增区域内的内切酶。由于大多数非特异性扩增的 cDNA 产物不 能被后一个限制性内切酶酶切，因而也就不会被克隆．从而增加了克隆的选择效 率。 还可以用在基因特异性引物的 5’端掺人一个限制性内切酶的酶切位点的方 法来克隆。 最后， 从两个有相互重叠序列的 3’和 5’RACE 产物中获得全长 cDNA。 或者通过分析 RACE 产物的 3’和 5’端序列，合成相应引物来扩增 mRNA 的反转 录产物，从而获得全长 cDNA。 第三 RACE 的应用 RACE 技术主要是应用于对全长 cDNA 序列的获得，但对该技术进行一定的修 改后，也可在其它方面显示出极高的应用价值。 首先，RACE 技术可用于 cDNA 文库的构建及筛选。Belyavaasky 等(1989)用 10 个骨髓瘤细胞分离的总 RNA，通过 TdT 加同聚尾、(dT)16 引物反转录，接着 用(dC)13 和锚定引物扩增的方法建立了一个 106 克隆的 cDNA 文库。同时，用该方法构建文库的优点是它们都只需要很少量的实验材料。建喜等(2001)利用 RACE 技术从已经构建的 cDNA 文库中成功克隆了家兔精子膜蛋白基因。 其次，应用 RACE 克隆已知片段的旁侧内部序列(neighboring internal sequence)。 Fritz 等(1991)以及 Struck 等(1994)分别用该法获得了 3’端和 5’ 端的旁侧序列。Zhang (1996)应用 LA-PCR 方法获得了特异基因的 5’末端非编 码和编码序列，省去了构建及筛选基因组文库的麻烦。王东等(2003)利用 RT-PCR 和 RACE 技术从玉米中获得一个长度为 2469bp F2KP