美国红鱼鱼鳞的Ⅰ型胶原纯品的制备和性质研究.pdfVIP

三、海洋资源开发与利用 美国红鱼鱼鳞的I型胶原纯品的制备和性质研究 陈思谨，易瑞灶木，陈俊德，陈晖 (国家海洋局第三海洋研究所海洋生物资源化学与化工研究中心，福建，厦门361005) 摘要：本文通过将一系列包括生物酶切，盐析以及膜分离在内的分离技术结合，从美国红鱼 鱼鳞中制备I型胶原纯品。纯化后的鱼鳞胶原在反相色谱中显示一个峰，在SDS中 显示为(0【1)za2组合的异型三聚体。氨基酸分析美国红鱼鱼鳞I型胶原，其氨基酸中含有的亚 品少。通过乌氏粘度法测定胶原的变性温度显示：鱼鳞l型胶原低于陆地动物的I型胶原， 但高于同类型的水生动物l型胶原。傅立叶红外光谱法分析显示鱼鳞I型胶原保持较好的 三螺旋结构和较高水平的分子内交联和分子次序。美国红鱼鱼鳞胶原是典型的I型胶原， 并在功能食品和生物材料领域有较大的运用潜力。 关键词：I型胶原；纯化；美国红鱼鱼鳞；性质 l介绍 胶原是动物组织中最大量的蛋白质，它广泛分布在皮，骨，软骨，腱，韧带，血管。角 膜或其他脊椎动物的器官中【ll。l型胶原是被最广泛研究的胶原。它的主要特征是由三条右 手螺旋的多肽链(旺l伽【2构成超螺旋结构。I型胶原被广泛应甩予皮革、食品、化妆品和生物 膜工业。由于I型胶原的良好的生物降解性，低毒性，良好的生物相容性和弱抗原性，它 使用在药学、生物医学、生物技术材料方面。 目前，众多领域的l型胶原来源还主要局限于陆生动物，例如：牛皮或猪皮。但由于 疯牛病和口蹄疫的传播以及在许多穆斯林地区仍存在着严格的宗教禁令，所以寻找可替代的 胶原来源显得尤为重要。鱼鳞由大量的I型胶原组成，且表面覆盖着钙盐。由于它是鱼类 加工工业的副产品，所以方便获取并且价格低廉。因此，它是一种安全而合适的l型胶原 来源，引起科学家的广泛关注。 在本文中，为了保证提取的胶原的三螺旋结构被最小破坏，美国红鱼鱼鳞I型胶原纯 晶被一系列分离制备方法提取纯化。通过SDS和RP-HPLC，我们可以定性和定量判 断胶原的纯度。另外，探讨美国红鱼鱼鳞I型胶原的一些生化性质，如氨基酸组成、变性 温度和三螺旋结构，同时其与热稳定性的关系也在本文中被讨论。 2原料与方法 2．1．原料 美国红鱼鱼鳞来自福建省厦门市的渔业加工厂。先用自来水洗净，在太阳底下晒干，样 品放入聚乙烯袋内，放置在。25C1-冷藏。 2．2化学试剂 基金项目：海洋三所基本科研业务费专项资助项目(海三科2010004) 782 ★第五届青年海洋科学研讨会论文集★ 三文鱼鱼皮I型胶原从Wako化学试剂公司购买(Tokyo，Japan)。 2．3美国红鱼鱼鳞I型胶原的制备与纯化 预处理、制备、纯化的所有步骤都在4。C条件下。 2．4纯度分析 2．4．3聚丙烯酰胺电泳法 分析I型胶原的纯度。胶原样品以l：l的比例来溶解于去离子水中。取10此胶原液，加入 40此的5×样品缓冲液，100C煮沸5min，进行SDS．PAGE垂直板电泳。浓缩胶的浓度为 3％(w／v)，分离胶的浓度为6．5％(W／v)。染色液：考马斯亮蓝R250溶液。胶原的分子量用高 分子量标准蛋白作为标记物。 2．4．4反相高效液相色谱 在进行高效液相色谱分析之前，纯化的I型胶原用1．0M的乙酸溶解至浓度5mg／ml，并 通过0．45wn孑L径的醋酸纤维素膜过滤。色谱仪我们使用戴安高效液相色谱系统。采用反相色 x illm250mnlZORBAX300 谱柱(4．6 SB)。进样量为201J1。流动相包含两种溶剂：(A)5％乙 nlil。 ml／min。检测波长220 2．5．I型胶原的生化性质 2．5．1氨基酸分析 ICS．300离子色谱仪分析水解产物的氨基酸含量。 2．5．2热稳定性分析 本文参考张的方法【21并在其上做部分修改，使用乌氏粘度计测定胶原粘度的变化来判定 热稳定性。变性温度Td，即相对粘度卸．5处的对应温度。 2．5．3傅立叶红外光谱法 Electron 本文使用傅立叶红外光谱仪(NicoletNexus，ThermoCo．，Madison，wI)测定胶原 的FT取光谱，检测波长范围为4000-400cml(2．5-25岬)。