小鼠CCL2基因毕赤酵母表达载体的构建及鉴定.pdfVIP

江苏农业科学 2011年第 39卷第 4期 王 东，李海军，高剑峰．小 鼠CCL2基因毕赤酵母表达载体的构建及鉴定 [J]．江苏农业科学，2011，39(4)：33—35 小鼠CCL2基因毕赤酵母表达载体的构建及鉴定 王 东，李海军，高剑峰 (石河子大学生命科学学院新疆石河子 832003) 摘要 ：从小 鼠肝脏组织 中提取总 RNA，利用 RT—PCR技术扩增小 鼠CCL2基 因序列 ，构建小 鼠CCL2cDNA毕赤 酵母表达载体 ，并进行鉴定及序列测定。结果表明，克隆获得的480bp片段与 GenBank里登录号为 AF065929和 AF065930的cDNA序列完全一致 ，将 目的基因正确插入毕赤酵母表达载体pPICZctA分泌信号肽下游。为大量获得小 鼠趋化因子 CCL2，以及对其生物学功能的研究奠定了试验基础。 关键词：CCL2；毕赤酵母 ；分泌型表达载体 中图分类号：Q51 文献标志码：A 文章编号：1002—1302(2011)04—0033—03 CCL2又名单核细胞趋化蛋 白一1(MCP一1)，是一类趋 剂均为国产分析纯。 化因子。趋化因子是一类具有相似分子结构的超家族趋化性 1．3 小鼠肝脏组织总 RNA提取 细胞因子，依其一级结构中N端高度保守序列的4个半胱氨 小鼠肝脏组织分离后迅速置于液氮中，然后投于液氮罐 酸残基中前 2个的排列分布状况的不同被分为4类：C、CC、 中冷冻备用。采用TRIzol试剂，按照操作说明抽提总RNA， CXC、CXC”。CCI_2属于其中的第2类，并且是最早发现并 溶于无RNA酶的无菌水中一80℃超低温冰箱冷冻备用。通 被广泛研究的CC类趋化 因子家族的成员之一。CCI2在慢 过 甲醛变性琼脂糖凝胶 电泳和紫外分光光度仪检测抽提总 性炎症疾病中发挥重要的调节作用，研究最为透彻的是在动 RNA的质量和浓度 。 脉粥样硬化中的作用，并且 CCL2与肿瘤的发生发展也有着 1．4 引物设计和 RT—PCR 密切的关系 。近年来，CCL2在肝脏疾病发病机制中的作用 根据 GenBank登录号为 AF065929的小 鼠CCL2cDNA序 越来越受到重视。大量研究表明，CCL2在各种肝损伤中表达 列设计合成 1对 引物 ：P1：5一GTGGAATrCATGCAGGTC． 均上调 。此外，最新研究发现，人早孕蜕膜组织和蜕膜基 CCTGTCATGCT一3；P2：5一GG!!垒 GGcATcAcAG cc 质细胞均高水平转录和翻译 CCL2，培养的基质细胞能分泌大 GAGTCAC一3。其 中P1和 P2的划线部分分别为EcoRI和 量的CCL2，其分泌量呈时间依赖性。因此认为 ，早孕蜕膜高 XbaI酶切位点，并且 P2在终止密码下游。以提取的总RNA 表达和分泌CCL2可能参与早孕期母 一胎免疫调节 。J。而 为模板，用QIAGEN公司的LabelStarTMArrayKit中的反转录 更为重要的一点是，笔者所在课题组通过大量试验发现 ，小 鼠 部分试剂盒进行反转录 (具体操作步骤见 LabelStarTMArray CCL2用原核表达系统表达时，有使细菌致死的现象，因此笔 Kit)，并进行 目的基因的PCR扩增。循环条件：94℃预变性 者认为CCL2很有可能是一种抗菌肽。为了探明CCL2是否 1min，再 94℃ 45s，58．5℃45S，72℃90S，35个循环后 具有抑菌效果，本研究对小 鼠CCL2的基因编码区cDNA进 72℃延伸 8min。 行克隆，构建了毕赤酵母分泌型表达载体并进行了序列测定 ， 1．5 酵母表达载体pPICZc~A—CCL2的枸建 旨在为进一步研究奠定基础。 毕赤酵母表达载体构建策略如图1所示。电泳回收PCR 扩增产物，用 EcoRI和XbaI对回收片段和p