甲状旁腺素受真核表达载体的构建及稳定转染真.pdfVIP

·956 · doi 10.3969/j.issn. 1673-4254.2013.07.04 J South Med Univ, 2013, 33(7): 956-961 基础研究 甲状旁腺素受甲状旁腺素受体体真核表达载体的构建及稳定转染真核表达载体的构建及稳定转染HEKHEK293293 细胞细胞 系系的建立的建立 孟 越，谢苗苗，林 振，袁 亮，李 威，郝 松，杨德鸿 南方医科大学南方医院脊柱骨科，广东 广州 510515 摘要：目的构建小鼠甲状旁腺素受体（PTHR）及其突变受体（DSEL）全长结构基因真核表达载体，建立稳定高表达PTHR 及 DSEL 的HEK293 细胞系，以应用于甲状旁腺素（PTH）模拟肽活性药物筛选及其信号通路的研究。方法 通过双酶切、胶回收方 法分别纯化目的片段(PTHR、DSEL 基因)和质粒pcDNA3.1（+ ），二者分别由DNA 限制性内切酶EcoR Ⅰ与Not Ⅰ双酶切，经T4 DNA Ligase 连接的方法将PTHR、DSEL 基因克隆到质粒表达载体pcDNA3.1（+ ）中，采用测序方法及DNA 限制性内切酶EcoR Ⅰ与Not Ⅰ双酶切方法鉴定重组质粒，脂质体转染法将重组体pcDNA3.1（+ ）-PTHR、pcDNA3.1（+ ）-DSEL 及空质粒pcDNA3.1 （+）分别转染至HEK293 细胞，经G418 筛选抗性细胞克隆，、RT-PCR 及ELISA 检测转染细胞PTHR、DSEL 的表达情况。结果 重 组质粒经基因测序及DNA 限制性内切酶EcoR Ⅰ与Not Ⅰ双酶切证实质粒表达载体pcDNA3.1（+）-PTHR、pcDNA3.1（+）- DSEL 构建正确。重组体经脂质体法转染HEK293 48 h 后，经G418 筛选3 周得到细胞抗性克隆，ELISA 检测到PTHR、DSEL 基因在 重组质粒表达载体pcDNA3.1（+ ）-PTHR、pcDNA3.1（+ ）-DSEL 转染的HEK293 中成功表达。RT-PCR 方法检测到PTHR、DSEL 基因在转录水平的表达。ELISA方法检测到重组质粒转染的HEK293 中，加入甲状旁腺激素刺激后，PLC、cAMP蛋白表达量远高 于空质粒pcDNA3.1（+）转染的HEK293 中PLC、cAMP 的表达。结论 成功构建了稳定高表达PTHR、DSEL 的HEK293 细胞，该 稳定转染细胞系的建立为进一步研究甲状旁腺素受体下游信号通道的分子机制以及筛选其模拟肽作用的活性奠定了实验基础。 关键词：小鼠PTHR ；真核表达；全长结构基因；稳定转染 Establishment of HEK293 cell lines stably expressing human parathyroid hormone receptors MENG Yue, XIE Miaomiao, LIN Zhen, YUAN Liang, LI Wei, HAO Song, YANG Dehong Department of Spinal Surgery, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China Abstract: Objective To establish HEK293 cell lines with stable expression of human parathyroid hormone (PTH) receptors. Methods The purified gene fragments of PTH-related peptide receptor (PTHR) and its mutant form (DSEL) were cloned separately into pcDNA3.1(+) vector after digestion with EcoR I and Not I, and the resulted pcDNA3.1(+)-PTHR and pcDNA3.1 (+)-DSEL plasmids were verified by restriction enzyme digestion and