生物工业分析六色层分析法.ppt

色层分析法 　　3.实验方法与步骤 　　（1）葡聚糖凝胶的预处理 　　取3克葡聚糖凝胶（Sephadex-25）干粉，浸泡于50ml蒸馏水中充分溶胀（室温，12h），然后反复倾斜除去表面的悬浮微粒，再加入pH7.0磷酸缓冲液沸水浴中2～3h去除颗粒内部空气，最后加入pH7.0磷酸缓冲液浸泡过夜备用。 　　（2）装柱 　　将层析柱垂直固定在铁架台上，将层析柱下端的止水螺丝旋紧，向柱中加入约1～2cm高的缓冲液，把溶胀好的糊状凝胶边搅拌边倒入柱中，最好一次连续装完，若分次装入，需用玻璃棒轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出现分界面。装柱长度至少8cm。自然沉降20min，最后放入略小于层析柱内径的圆形滤纸片，以防将来加样时凝胶被冲起。 色层分析法 　　（3）平衡 　　以恒流泵控制流速为1滴/5秒，用磷酸缓冲液洗脱平衡10min。注意在任何时候不要使液面低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。 　　（4）血红蛋白样品的制备 　　取1ml抗凝血于烧杯中，加入10ml 20mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0），再加入固体铁氰化钾，使浓度达到5mg/ml。 　　（5）层析柱还原层的形成 　　取1ml 40mmol/LFeSO4于小烧杯中，加入1ml 0.2Mmol/LNa2HPO4,80mmol/L Na2H2EDTA混合液搅拌均匀。待层析柱上缓冲液几乎全部进入凝胶时，速取该混合液0.4ml加入层析柱中，待混合液完全进入柱床后加入0.7ml缓冲液。（注意还原剂的混合液要新鲜配制，尽可能缩短在空气中暴露的时间）。 色层分析法 　　（6）上样 　　将柱中多余的液体从底部流出后关闭止水螺丝,取前面制备好的血红蛋白样品0.5ml，将样品溶液小心加到凝胶柱上，打开止水螺丝，使样品溶液流入柱内。 　　（7）洗脱 　　用缓冲液进行洗脱，控制缓冲液在约0.75ml/秒的流速，观察并记录实验现象。 　　（8）清洗 　　待所有色带流出层析柱后，加快流速，继续清洗层析柱2min。回收凝胶，以备再用。 色层分析法 　　（2）点样 　　取一张19×23厘米新华滤纸1号，在右下角距两底边各2厘米交点处理用毛细管点上样品溶液，见图5-23，点的直径应小于0.5厘米，共点5-8次。 另取一张19×23厘米新华滤纸1号，按上法用毛细管点上各种标准氨基酸溶液，每种氨基酸各点二次。此滤纸用作标准氨基酸的双向层析图谱。 色层分析法 　　（3）展开 　　将点样后的两边滤纸在相同的操作条件下，用上升法进行双向展开。 　　①酸向展开：以滤纸19厘米长的一边为高，用线缝成圆筒形（注意，纸的两边不相碰），放在盛有酸向展开剂的层析缸内饱和约1小时，然后将滤纸有样品的一端放入展开剂中，待溶剂前沿上升至距顶端约0.5厘米处时取出，吹干至无正丁醇味为止。 　　②碱向展开：将酸向展开后的滤纸在溶剂前沿的一端切去约1厘米，把滤纸转90°，以23厘米长的一边为高，用线缝成圆筒形，放入盛有碱向展开剂的层析缸中，并以12%氨水作为平衡溶剂，饱和约1小时，然后将滤纸放入展开剂中展开，待溶剂前沿到达滤纸顶端约0.5厘米处时，取出吹干。以同样条件碱向再展开一次，吹干。 色层分析法 　　（4）显色 　　将吲哚醌显色剂喷射整张滤张，吹干至乙酸味不太重时，放入100℃烘箱中5-10分钟，取了。将滤纸放入盛有吲哚醌底色褪色剂的搪瓷盘中褪去底色，此时各种氨基酸呈现不同的颜色。再将滤纸用自来水冲洗，立即用铅笔将斑点圈出。 　　4.氨基酸的定性鉴定 　　以样品的层析图谱与标准氨基酸的层析图谱相比较，根据斑点的位置与颜色鉴定啤酒中所含氨基酸的种类。 色层分析法 　　5.讨论 　　①吲哚醌显色剂与氨基酸所生成的颜色和显色剂的配制方法有关，因此必须使用同一次配制的显色剂进行显色。此外，同一氨基酸在不同pH值下所显的颜色也有差异，因此必须除尽滤纸上的展开剂后才能显色。 　　②为了确定各种氨基酸在双向层析图谱上的位置，可以将各种不同氨基酸，按上述同样的操作条件，分别在酸向展开剂与碱向展开剂中进行单向上升法展开，分别求出它们在两向中的Rf值，然后以所求得的Rf值以及斑点颜色来确定各种标准氨基酸在双向图谱上的位置。 色层分析法 　　③本法所用的展开剂对于丝氨酸与甘氨酸，缬氨酸与蛋氨酸不易被完全分开，但可以根据它们的Rf值与斑点颜色的不同来辩认。如果将纸上层析与纸上电泳合并使用（称电泳层析法），就可以完全分离清楚。 　　④由于各种氨基酸在本实验所用的碱向展开剂中的Rf值较小，故需展开二次。如用含酚或吡啶的溶剂系统来展开时只需一次，但酚与吡啶必须经蒸馏纯化后才能使用，且酚展开时速度较慢。 色层分析法 　　五、酿造酒中黄曲霉毒素的测定 　　1.原理 　　黄曲霉毒素B1在紫外线