酵母操作手册-酵母的冻存、复苏以及培养.doc

酵母操作手册 （一）酵母的冻存、复苏以及培养 注：本手册改编自商业化酵母操作方案，依据本实验条件修改，并不适合所有实验室！ 培养基配方： 10X Dropout 1L） AA Name 所购数量 ( g ) 10X 浓度 (mg/L) 实称 （g） L-Isoleucine 5 300 0.3 L-Valine 25 1500 1.5 L-Arginine HCl 50 200 0.2 L-Lysine HCl 50 300 0.3 L-methionine 10 200 0.2 L-Phenylalanine 10 500 0.5 L-Threonine 10 2000 2 L-Tyrosine 25 300 0.3 L-Uracil 25 200 0.2 共计 5.5 将各AAs称量后，在研钵中磨合混匀，置于干净器皿中。 单独用AA筛选溶液 AA名称 体积 ( ml ) 浓度（mg/ml） 实称 （g） L-Adenine hemisulfate salt 100 2 0.2 100 X L-Histidine HCl monohydrate 100 2 0.2 100 X L-Leucine 100 10 1 100 X L-Tryptophan 100 2 0.2 100 X 过滤除菌 YPDA（1L） 浓度 实称 （g） Difco peptone 20 g/L 20 Yeast extract 10 g/L 10 Agar (for plates only) 20 g/L 20 Glucose 2% 20 Adenine hemisulfate 0.003% 15 ml 0.2%Ade SD Media （1L） 浓度 实称 （g/ml） 加H2O至1000ml, 114℃，20min。 YNB 6.7 g Agar(for plates only) 20 g Glucose 2% 20 10X基本DO 粉剂 0.55 g 100X单独用AA 10 ml 1． 长期冻存： 无营养缺陷型的酵母株存在含25％甘油的YPDA中，然后冻存于-70冰箱中，若要保存大于一年，务必使温度不要低于-55。 转染质粒的营养缺陷型酵母株存在含25％甘油的相应的缺陷型培养基（SD）中，以避免质粒丢失。 制备方法： 用无菌牙签从琼脂板上将一个单克隆挑出，置于含200－500μlYPDA或SD的1.5ml离心管中，注意尽量使牙签上的菌落都涮在溶液中，然后盖好盖，在旋涡器上剧烈振荡混匀，再加入无菌甘油，使其终浓度为25％，再次振荡混匀，存于-70冰箱中。 2． 复苏： 准备一无菌1.5ml离心管，加入100-200μl YPDA或SD，用无菌牙签挑取些许冻存菌置于离心管中，稍微涮洗一下牙签（让挑取的冰屑融化），混匀后吸取100μl涂平板，30培养2－3天。 刚长出克隆的平板用封口膜密封后，在4可保存1－2个月。 注意：有时冻存的酵母可能沉到离心管底部，所以在复苏时，将其全部融化，然后振荡混匀，再复苏。 3．酵母的液体培养： 用无菌牙签挑取一个两个月以内的酵母克隆，每5ml液体培养基所需的克隆大小为2－3mm，所以，如果单个克隆不够，可以多挑几个。剧烈振荡，使酵母细胞分散到液体中，30，200rpm振荡培养16－18hr，但通常好像需要24hr，甚至更长才能达到稳定期（OD600 1.5），所以一般在上午开始摇，第二天下午收。 如果需要中期培养物，则将上面的稳定期培养物稀释到OD600 = 0.2-0.3之间，然后30，200rpm振荡培养3－5hr，此时的培养物OD600 = 0.4-0.6之间。可见酵母的细胞周期约为3－5hr。 （二）质粒转化酵母细胞手册 试剂配方：  单链Carrier DNA （SS-DNA）(2 mg/ml) 注意：你不需要将Carrier DNA超声切割，因为实验证明Carrier DNA越大效果越好！只要如下操作即可。 1200mg高分子量DNA（III型脱氧核糖核酸钠盐，鲑鱼精DNA，Sigma D1626），溶于100ml TE（10mM Tris.HCl, PH 8.0, 1.0mM EDTA）。先用10ml枪头吹吸使DNA湿化，然后用磁性转子于4℃缓慢搅拌过夜使其完全溶解；如果紧急，也可于室温剧烈搅拌2 – 3hr使其完全溶解。 2． 将其直接分装成1ml/管，储存在-20℃。 3． 使用之前，先取出一管沸水浴至少5分钟，然后迅速放置于冰上骤冷。 要点： I：Carrier DNA沸水浴后可以用3至4次而不需要再次沸水浴。如果转化效率开始降低，请再将其沸水浴或重新换一管。 II：本