SD大鼠全脑缺血-再灌注损伤模型.docVIP

SD大鼠全脑缺血-再灌注损伤模型 一、实验目的： 掌握SD大鼠全脑缺血-再灌注损伤模型的建立方法。 掌握取SD大鼠海马匀浆、测蛋白，使用试剂盒测定SOD、MDA、CAT的方法。 讨论全脑缺血-再灌注损伤的机理。 二、实验原理： 脑缺血一定时间恢复血液供应后，其功能不但未能恢复，却出现了更加严重的脑机能障碍，称之为脑缺血再灌注损伤。 脑缺血再灌注损伤与自由基的生成、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸毒性、白细胞高度聚集和高能磷酸化合物的缺乏等有关。脑缺血后短时间内ATP、CP、葡萄糖、糖原等均减少，乳酸明显增加。缺血期cAMP含量增加，而cGMP含量减少。缺血-再灌注后脑内cAMP进一步增加，cGMP进一步下降，这提示缺血-再灌注时脂质过氧化反应增强。脑是一个富含磷脂的器官，再灌注后cAMP升高可导致磷脂酶激活，使膜磷脂降解，游离脂肪-酸增多，最显著的是花生四烯酸及硬脂酸增多，自由基与游离脂肪酸作用使过氧化脂质生成增多。脑缺血时脑细胞生物电发生改变，出现病理性慢波，缺血一定时间后再灌注，慢波持续并加重。缺血-再灌注损伤时间越长，兴奋性递质含量越低，脑组织超微结构改变也越严重。 三、实验材料 动物：SD大鼠（200g左右，雌雄不限） 药物：20%水合氯醛，Folin-酚试剂，SOD、MDA、CAT试剂盒。 器材：鼠板，注射器，电凝器，剪刀，绳子，匀浆机，分光光度计，恒温水浴箱，试管。 四、实验方法 1.取7只SD大鼠,称重，编号并记录。7只大鼠分别以20%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，俯卧位固定，在枕骨后切开皮肤，暴露第一颈椎两侧的翼小孔，用尖端直径为0.5mm的电凝器插入翼孔，烧灼双侧的椎动脉，造成永久性闭塞。 2.待大鼠适应24h后，在颈部正中切口，暴露双侧颈总动脉，各组大鼠均用动脉夹夹闭阻断， 15min后松开动脉夹恢复血流，进行再灌注，第1组再灌注0分钟；第2组再灌注15分钟；第3组再灌注30分钟；第4组再灌注45分钟；第5组再灌注60分钟；第6组再灌注90分钟。第7组为对照组，处理同以上组，但不结扎双侧颈总动脉。缺血时保持其直肠温度在36.5-37.5℃之间。以缺血动物体征表现判断缺血模型的可靠性。 3.再灌注后取SD大鼠海马，用匀浆机匀浆，再Lowry法（Folin-酚试剂法）测定蛋白质浓度。具体操作如下：1.标准曲线的绘制：取7支干燥的试管，编号，加入不同浓度梯度的牛血清蛋白液，分别加入蒸馏水，碱性硫酸铜试剂，10分钟后加入Folin-酚试剂，混匀，40℃，10分钟，500nm波长比色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。2.样品测定：准确吸取样液0.5ml于干燥的试管中，同样加入以上试剂，测出光密度值后，对照标准曲线求出样液的蛋白质浓度。 4. 按照试剂盒说明书的操作步骤，测定每一实验组的超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、过氧化物氢酶（CAT）值。 具体操作如下： （1）. 超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒： 试 剂 测 定 管 对 照 管 试剂一(ml) 1.0 1.0 样品(ml) a* 蒸馏水(ml) a* 试剂二(ml) 0.1 0.1 试剂三(ml) 0.1 0.1 试剂四(ml) 0.1 0.1 用旋涡混匀器充分混匀，置37℃恒温水浴40分钟 显色剂(ml) 2 2 混匀，室温放置10分钟，于波长550nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，比色。 注：a*代表样本取样量和双蒸水取样量； 计算SOD值： (2). 丙二醛（MDA）试剂盒： 标准管 标准空白管 测定管 测定空白管** 10n mol/ml标准品(ml) a* 无水乙醇（ml） a* 测试样品（ml） a* a* 试剂一（ml） a* a* a* a* 混匀（摇动几下试管架） 试剂二（ml） 3 3 3 3 试剂三（ml） 1 1 1 50%冰醋酸（ml） 1 旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴（或用锅开盖煮沸）40分钟，取出后流水冷却，然后3500~4000转/分，离心10分钟，（3000转/分以下离心时间需延长，目的使沉淀完全）。取上清，532nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。 注：a* 表示所取的样品量、标准品量、无水乙醇的量、试剂一的量，四者均相等。 计算MDA值： （3） 测定管 试剂一（37℃预温）（ml） 1.0 1.0 试剂二（37℃预温）（ml） 0.1 0.1 1%组织匀浆（ml） 0.05 混匀，37℃准确反应1分钟（60秒） 试剂三（ml） 1.0 1.0 试剂四（m